本发明公开了一种快速逆转录microRNA文库的方法。本发明方法是在逆转录时通过使用PolyA加尾酶,在所有miRNA的末端增加一段PolyA序列,同时将逆转录引物中与miRNA特异性结合的部分换成可以与PolyA序列相结合的PolyT序列,并将加PolyA尾和逆转录合为一步进行,使所有miRNA的逆转录可以使用相同的逆转录引物,从而一次性完成全部miRNA的逆转录。使用本发明方法可以极大的简化实验步骤,为实验带来方便,适于实验室推广应用。
1.一种快速逆转录microRNA文库的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1.xa0以SW480细胞株提取的总RNA为模板,置于冰上解冻,dNTPs和5×buffer则置于室温解冻,待其完全解冻后,轻弹管壁,使液体完全混合,离心使管壁上的液体流下,然后将试剂置于冰上存放;xa0xa0xa0xa0xa0S2.xa0如下表所示混合各个配方:成分体积/反应5x buffer4μL10mM dNTPs2μL10mM ATP1μLRnase-free 水Variable反转录酶1μLPolyA聚合酶1μL抑制剂1μLSEQ ID NO:5所示的引物1μLSEQ ID NO:6所示的U6引物1μL模板RNAVariable总体积20μLS3.xa0将以上各组分混合后,轻轻颠倒混匀并离心,置于冰上保存;xa0S4.xa037°C孵育60min;S5.xa085°C孵育5min,置于冰上保存;S6.xa0而后即可以此为模板进行real-timexa0PCR,或置于-20°C冷冻保存。技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体涉及一种快速逆转录microRNA文库的方法。
背景技术
miRNAxa0的逆转录一般是使用茎环结构和含有6个碱基的特异性序列设计合成特异性引物(如图1所示),但由于其碱基的特异性结合,故此方法每一次逆转录只能完成1种或几种末端碱基序列相同的miRNA的逆转录,当需要检测多个miRNA的表达情况是,这种方法就变得尤为繁杂,需要对每一种miRNA引物单独设计和逆转录。
发明内容
本发明的目的在于为了克服需要逆转录多个miRNA时增大的繁杂工作量,提供一种简单、快速逆转录microRNA文库的方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:在逆转录时通过使用Polyxa0A加尾酶,在所有miRNA的末端增加一段Polyxa0A序列,同时将逆转录引物中与miRNA特异性结合的部分换成可以与Polyxa0A序列相结合的Polyxa0T序列,并将加Polyxa0A尾和逆转录合为一步进行,使所有miRNA的逆转录可以使用相同的逆转录引物,从而一次性完成全部miRNA的逆转录。与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明将加Polyxa0A尾和逆转录合为一步进行,使所有miRNA的逆转录使用相同的逆转录引物,克服需要逆转录多个miRNA时增大的繁杂工作量,简化的实验步骤。
附图说明
图1为传统茎环结构;其中,1.miRNA,2.传统逆转录引物,3.逆转录所得cDNA;xa0图2为Polyxa0A加尾逆转录方法示意图;其中,1.miRNA,3.逆转录所得cDNA,4.使用Polyxa0Axa0加尾酶加A尾,5.与逆转录引物结合开始逆转录,6.本发明使用的逆转录引物,7.使用荧光定量PCR检测,8.miRNA特异性引物,9.反向引物;图3为U6扩增曲线;图4为U6溶解曲线导数图;图5为miRNA150扩增曲线;图6为miRNA150溶解曲线;图7为miRNA200a扩增曲线;图8为miRNA200a溶解曲线;图9为miRNA30b扩增曲线;图10为miRNA30b溶解曲线;图11为RNA用量与U6C(t)关系图。图12为RNA用量与miRNA150xa0C(t)关系图。图13为RNA用量与miRNA200axa0C(t)关系图。图14为RNA用量与miRNA30bxa0C(t)关系图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。1.xa0以SW480细胞株提取的总RNA为例,取模板RNA置于冰上解冻(为全部RNA,需含有miRNA),dNTP和5×buffer则置于室温解冻(15-25°C)。待其完全解冻后,轻弹管壁,使液体完全混合。离心使管壁上的液体流下,然后将试剂置于冰上存放。2.xa0如下表所示混合各个配方,混合后置于冰上保存。成分体积/反应5x buffer4 ul10mM dNTP2 ul10mM ATP1 ulRnase-free waterVariableReverse Transcriptase1 ulPoly A Polymerase1 ulInhibitor1 ulPrimer(如SEQ ID NO:5所示)1ulU6 Primer(如SEQ ID NO:6所示)1ulTemplate RNAVariableTotal20 ul3.xa0将以上各组分混合后,轻轻颠倒混匀并离心,置于冰上保存。4.xa037°C孵育60min。5.xa085°C孵育5min,置于冰上保存。6.xa0而后即可以此为模板进行real-timexa0PCR,或置于-20°C冷冻保存(图2)。此逆转录方法已使用real-timexa0PCR检测,分别用200ng,20ng,2ng,0.2ng进行逆转录,而后使用荧光定量PCR检测,U6为对照结果如图3-14所示。U6(如SEQxa0IDxa0NO:1所示)与miRNA150(如SEQxa0IDxa0NO:2所示)miRNA200a(如SEQxa0IDxa0NO:3所示),xa0miRNA30b(如SEQxa0IDxa0NO:4所示)xa0PCR结果均为单峰,且如图11-14所示,U6与miRNA150,xa0miRNA200a,xa0miRNA30b的趋势线的斜率均在-1.1~xa0-0.9之间,故此方法完全可以反映出浓度的变化。申请人:深圳北京大学香港科技大学医学中心发明名称:一种快速逆转录microRNA文库的方法xa0SEQxa0IDxa0NO:1名称:U6序列:xa0gtgctcgcttxa0cggcagcacaxa0tatactaaaaxa0ttggaacgatxa0acagagaagaxa0ttagcatggcccctgcgcaaxa0ggatgacacgxa0caaattcgtgxa0aagcgttccaxa0tattttxa0SEQxa0IDxa0NO:2名称:miRNA150序列:ucucccaacccuuguaccagugxa0SEQxa0IDxa0NO:3名称:miRNA200a序列:uaacacugucugguaacgauguxa0SEQxa0IDxa0NO:4名称:miRNA30b序列:uguaaacauccuacacucagcuxa0SEQxa0IDxa0NO:5名称:primer序列:GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTTTTTTT-V-Nxa0SEQxa0IDxa0NO:6名称:U6xa0primer序列:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT